微型的Cas核酸酶助力猛犸象公司的发展

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微小的Cas核酸酶对猛犸象公司起到的作用

直到最近,猛犸生物科学公司还是一家使用CRISPR技术的诊断公司,但通过与Vertex Pharmaceuticals新宣布的合作伙伴关系,猛犸象在治疗领域的工作变得更加直言不讳。该公司专门从事紧凑型CRISPR系统,如Cas14和CasΦ,具有独特的特性。我们邀请了CSO和联合创始人Lucas Harrington就公司的资产和愿景进行了讨论。

Lucas Harrington是猛犸生物科学的首席战略官和联合创始人。他创立了制药CRISPR公司,同时在加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室完成了博士学位。照片由本人提供。

嗨,卢卡斯,很高兴见到你,并有机会与你交谈。

谢谢你伸出援手,高姆。

也许你应该先谈谈你自己,以及你是如何参与猛犸象的?

猛犸生物科学公司现在已经快四岁了,我们大约有120人。我和Janice Chen、Trevor Martin和Jennifer Doudna一起创立了这家公司。珍妮丝和我在加州大学伯克利分校的詹妮弗实验室做博士工作,我们发现了很多这样的新型紧凑型CRISPR系统。我们试图了解它们的一些性质和生物化学,我们有动力让我们的发现超越论文,看到这些东西被转化。

新公司的科学基础是什么?

我们在2018年初创办了Mammoth,最初专注于CRISPR诊断。我们开发了 DETECTR V 型反式切割系统来诊断 COVID-19,但公司的前提是将这些紧凑型系统的多样性用于它们可能适合的任何应用。所以现在一半的公司从事诊断工作,另一半从事治疗工作。我们还有一个小团队致力于CRISPR系统的核心发现和生物化学。

一半的尺寸可以完成整个工作

因此,从一开始,您就专注于非常紧凑的Cas核酸酶。Cas14的大小只有Cas9的三分之一,那么它怎么能继续工作呢?

这是一个非常好的问题,它让我们困惑了一段时间。当这些紧凑型效应子的结构发表时,证明它们形成同源二聚体。因此,这两个Cas14亚基聚集在一起,在引导RNA下搭建支架,形成一种复合物,更让人联想到Cas9或Cas12a。

已经有一些努力来切掉Cas9的一块并使其更小。值得注意的是,同源二聚体的形成是一种解决方案,如果你正在做蛋白质工程,你永远不会遇到。但是,经过数亿年进化的自然多样性已经能够磨练出这种真正优雅的尺寸问题解决方案。

CasΦ 含有约 750 个氨基酸,几乎是 Cas9 的一半大小,Cas9 含有 1368 个氨基酸。

 

CasΦ 含有约 750 个氨基酸,几乎是容纳 1368 个氨基酸的 Cas9 的一半。Cas14甚至更小,只有约500个氨基酸。图片由猛犸生物科学提供。

那么同源二聚体的形成是Cas14可以小于标准尺寸一半的原因吗?

是的,没错。功能蛋白的重量仍然与常规CRISPR系统大致相同,但将其编码为核酸将更有效。所有这些小型CRISPR系统都来自生命树的奇怪分支,如纳米古菌和比某些病毒小的其他类型的细菌。因此,存在巨大的进化压力,以使这些系统在基因组大小方面尽可能高效。所以他们找到了这个解决方案。

快速剔除带来更高的精度

小尺寸有优点还是缺点?

我们在任何Cas系统中寻找的关键特征是功效,即实际上有效地切割DNA,以及安全性,即最小或没有脱靶活性。

对于所有这些紧凑型系统,仍然有成千上万种不同的系统可供选择 - 其中一些是较高的保真度,一些是较低的保真度 - 这实际上是关于挖掘所有这些系统,直到找到具有所需功能的正确系统。在保真度方面,我们已经能够找到比Cas9的黄金标准更准确的系统。

这些紧凑型系统的小尺寸是其精度更高的原因吗?

我认为准确性更多地与Cas识别其基质的机制有关。Cas9具有非常复杂的系统,其中不同的蛋白质结构域查看底物并查看是否存在靶标匹配。这些小系统更直接一些;他们迅速拒绝偏离目标,而不是坐在他们身上并拥有一个聪明,复杂的机制。因此,如果它不是匹配的,他们只是再次将其吐出来。

小Cas核酸酶之间有什么不同和相似之处?

肯定有相当多的多样性。在Mammoth正在开发的不同平台中,我们试图利用各种功能。其中一些具有非特异性的附带活动,适用于诊断。其他人只做双链DNA切割,一些靶RNA等。最后,每个平台的可用性取决于疾病目标和我们需要进行的编辑类型。

大多数正在开发的CRISPR疗法都是基于Cas9的。您是否设想我们将来会看到更多专门的Cas核酸酶用于不同的疾病或不同目的?

出于监管目的,您仍然希望一个系统有多种用途。但是,我仍然认为使用SpCas9或Cas12a的第一代系统无法访问许多目标。

有时你想使用一种不产生内嵌的技术,或者你想敲低RNA或进行不同类型的整合。它不是一刀切的。关于CRISPR的很多炒作是,它是一种可以治愈所有疾病的通用工具,但实际上,它需要多个系统来实现这一点。这就是CRISPR工具箱方法的用武之地。

紧凑的尺寸为额外的货物留出了空间

Cas14和CasΦ是变体,但你是否也看到每组Cas核酸酶的多样性?

是的。即使在Cas14中,也有成千上万的变体具有不同的功能和属性。与CasΦ一样,其中也有相当多的多样性。一些多样性是自然的,但你也可以使用蛋白质工程来创造更多的多样性。一些公司非常注重工程,而另一些公司则更注重自然多样性。在猛犸象,我们把它们看作是互补的技能组合。有些具体问题比自然采矿可以更快地解决。对于其他问题,情况恰恰相反,例如Cas14的同源二聚体,这在工程中是不可能的。

我不能给出一个确切的数字,但有成千上万种不同的自然变体。随着越来越多的宏基因组项目探索那里的微生物暗物质,这个数字还在不断增长。

"我们正在研究的系统非常紧凑,因此您只使用了一半的AAV。这意味着另一半留给一些更精确的基因编辑方法,例如,碱基编辑或素编辑,占用额外的容量"卢卡斯·哈灵顿

您能举出任何可能最适合某些目的的特定Cas变体的示例吗?

好吧,我们没有公开披露我们的管道,所以我不能深入探讨太多。我们刚刚宣布与Vertex建立合作伙伴关系,但我们也没有透露这一渠道。但我认为AAV就是一个具体的例子。使用第一代系统,您只需将核酸酶和导轨几乎安装到AAV中即可。尽管如此,整个产能只是通过双股断裂来涵盖,这只会做非常传统的切割。

我们正在研究的系统非常紧凑,因此您只使用了一半的AAV。这意味着另一半留给一些更精确的基因编辑方法,例如,占用额外容量的碱基编辑或素编辑。只有使用小型Cas系统,我们才能将所有这些精确的基因编辑工具打包到AAV中。由于AAV是输送到肌肉,心脏,眼睛和中枢神经系统的首选,因此如果您从变体目录中选择正确的CRISPR系统,则可以开始利用该递送平台。

你能举一个疾病和Cas变体的例子,它们特别好地结合在一起吗?

当然,让我们把肌肉中的疾病。肌肉是一个关键区域,您希望使用正确的AAV血清型进行全身递送,并且需要选择一个可以很好地协同作用的CRISPR系统。例如,在杜氏肌营养不良症的情况下,您可能希望使用外显子跳过,因此您需要进行相当大的删除,并确保非常有效地敲除连接点。一些系统对基因组进行最小的更改,而其他系统对基因组进行较大的更改,因此您可以选择最适合您目的的变体。

您能透露一下您正在或将要治疗的疾病吗?

我不能说太多细节,但总的来说,由于我们酶的功能,我们非常专注于体内疗法。在这里,我们可以使用我们的紧凑型系统将东西送到靶器官。这是我们看到最显著差异化的地方,并希望做出最突出的适应症。很抱歉,我不能透露我们正在追求的任何特定疾病,但这是我们关注的一般参数。

CRISPR可以提供真正的精准医疗

你能告诉我你在这个过程中走了多远,以及你希望何时披露一些东西吗?

希望这不会太远,但这取决于很多事情。显然,我们是临床前的,并且仍然建立系统并针对特定适应症进行测试。一旦我们非常确信有一种疾病是我们正在追求的,我们就会传达出来。因此,我们没有一个艰难的最后期限,但我认为这不会太遥远。

在猛犸象实验室工作的科学家。照片由Mammoth Biosciences提供。

在猛犸象实验室工作的科学家。照片由Mammoth Biosciences提供。

您认为CRISPR未来最大的潜力在哪里?不仅仅是猛犸象,而是整个医疗领域?

我认为对于CRISPR领域来说,现在还为时尚早。我们还有几十年的工作要兑现这个平台的承诺。我认为这不仅仅是一项技术进步。CRISPR所实现的是真正的精准医学,你正在以个性化的规模进行基因编辑。

这不仅是一个技术挑战,也是一个监管挑战。我们如何处理你可能有十种不同的药物产品针对同一疾病的不同基因型的事情?在这里,您不必对每种化合物进行完整的处理;监管机构可以认识到你只是在改变引导RNA。您已经对引导RNA进行了一些安全性评估,但是它们所做的编辑本质上是相同的。我认为这才是真正的问题所在。这将需要很长时间,理所当然地,我们需要证明这些系统的安全性。

这就是我看到CRISPR的前景的地方。拥有一个系统,使我们能够治疗的疾病不仅仅是最大的疾病,影响数十万人,而且患者群体要小得多。

您认为为特定患者量身定制治疗方法是否可行?这难道不会伴随着高昂的价格标签吗?

我认为这就是CRISPR的发展方向。如果你想到像锌手指和TALENs这样的较旧的基因编辑技术,个性化治疗是不切实际的,因为每次编辑都需要不同的核酸酶。使用CRISPR,我们可以非常快速地推出新的治疗候选药物,因为该系统的强大之处在于它是高度可编程的。

但是,需要从安全角度以不同的方式看待此类治疗。如果您的患者人数为一百名患者,那么进行临床试验并实际证明安全性和有效性就变得具有挑战性。即使患有囊性纤维化,单个突变也会导致大多数患者的疾病,但更罕见的突变也可以从基因编辑中受益,在理想世界中,我们可以帮助所有患者,而不仅仅是亚群。我们需要能够治疗那些更罕见的疾病,我们有潜力用CRISPR做到这一点。

未来在于体内应用

您之前提到过,出于实际原因,猛犸象非常专注于体内系统。你认为这也是未来所在吗?

是的。这并不是说我们无论如何都反对离体疗法,但我认为,如果我们能够安全地做到这一点,体内疗法正是事情需要去的地方。进行离体治疗的挑战是取出细胞,编辑它们,扩展它们,调节患者,将细胞放回体内。使用体内疗法,您可能只需要一次静脉注射。就这些治疗方法的广泛程度而言,这确实是变革性的。

即使是非常成熟的方法,如CAR-T疗法,如果你能在体内移动它,想象一下你可以接触到多少患者,治疗对病人有多友好,以及你能做得多快。我认为这是一个巨大的机会

但是对于体内治疗,你需要非常非常确定患者体内发生的事情。那么,您将如何处理这个问题呢?

如果你正在系统地提供一些东西并针对身体的每个细胞,那么脱离目标的风险是一个直接的问题。但是,如果您靶向单个器官并且只编辑您正在查看的确切细胞,则可以降低这种风险。我认为其中很大一部分是关于再次交付的。

因此,对于全身递送,您需要对安全性与离体性进行非常不同的思考,在离体中取出特定类型的细胞,对其进行编辑并再次将其放回 - 这是一个更加受控的设置。但我认为这是可以实现的。这是可以做到的。

原文链接:微小的Cas核酸酶做猛犸象的工作

 

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