当前的基因编辑工具可以有效地破坏 DNA 序列或纠正与遗传性疾病相关的细微突变。虽然这些策略正在积极地用于临床应用，但大量患者将无法受益，因为他们的病情是由基因组缺失引起的。在这里，CMN 与巴塞罗那庞培法布拉大学的 Marc Güell 教授和 Avencia Sánchez-Mejías 博士进行了交谈，以了解更多关于他们可以修复人类基因组中相当大的缺陷的新基因写入技术 FiCAT。

截至2021 年12 月 30日，《人类在线孟德尔遗传纲要》表明 4,561 个基因的突变与人类遗传疾病有关。从潜在的突变类型来看，大约 22% 的已报道人类突变涉及缺失。正在为临床应用开发的最先进的基因编辑技术在有效和高效地纠正基因组 DNA 缺失方面的潜力有限。

Marc Güell 教授，Pompeu Fabra 大学 (UPF) 终身教授、Integra Therapeutics 联合创始人兼首席科学官和 UPF 高级研究员、Integra Therapeutics 联合创始人兼首席执行官 Avencia Sánchez-Mejías 博士. 

最近发表了两份开创性的科学报告，描述了旨在填补这一空白的新基因编辑技术 (1, 2)。在其中一篇发表于 Nature Communications的报告中，由 Pompeu Fabra 大学转化合成生物学实验室的 Marc Güell 教授领导的一个研究小组揭示了一种名为“FiCAT”的新基因写入工具——用于查找、切割和转移，该工具是专门开发用于修复基因组 DNA 中的相当大的缺陷。

建立在人类遗传学、分子和合成生物学方面的经验

»FiCAT 基因编辑的开发是我们在 2017 年启动实验室时启动的首批项目之一，«Marc Güell 教授说。»在我职业生涯的早期，我意识到我的科学兴趣集中在技术开发上。我的导师总是开玩笑说我更关注方法而不是实验的实际结果。这是一个很好的机会，可以继续我在哈佛医学院著名的乔治教堂技术实验室担任博士后研究员的职业。我觉得自己像个糖果店里的孩子！在那里，我开始致力于开发用于基因组重新编码的 CRISPR 方法，以使异种移植成为临床现实——该研究现在由一家名为 eGenesis 的公司继续进行。从波士顿，

Avencia Sánchez-Mejías 博士接任： »在塞维利亚大学获得临床遗传学博士学位后，我在迈阿密和新加坡从事分子肿瘤学博士后研究。基础研究，但始终旨在为癌症患者寻找新的治疗选择。当我回到西班牙时，Marc 刚刚启动了实验室，并介绍了精确基因编辑的研究兴趣。我受到了超级启发。在我攻读博士学位期间，我曾为携带各种遗传疾病的夫妇提供咨询。我们还为受影响的夫妇进行了早期胚胎植入前诊断，但这距离基因治疗可以对患有遗传疾病的儿童产生影响的现实还很遥远。通过开发用于临床的基因编辑技术，我们可以真正开始为这些需求未得到满足的患者带来改变。

定义基因写入研究挑战

已建立的基因编辑技术依赖于 DNA 模板通过同源定向修复 (HDR) 引入新的序列信息，受到低效率的阻碍，并且在插入片段大小增加时变得更无效。碱基编辑器甚至不适合纠正小的缺失，虽然标准的启动编辑可以纠正小的缺失，但需要新技术来设计大 DNA 编码区的精确传递。

»FiCAT 背后的基本理念是将 Cas9 的基因组精度和 DNA 靶向能力与高效的 DNA 转移活性相结合。这种综合能力将创造出一种基因编辑工具，能够一次纠正基因组缺失或精确重写大段基因组 DNA，”Güell 教授说。

此前，依赖于双链断裂修复过程的非同源末端连接的同源独立靶向整合 (HITI) 已成功用于特异性整合数千个碱基长度的 DNA 片段，并可能用于插入缺失的外显子. 然而，该技术可能无法提供恢复基因功能所需的大 DNA 片段，例如 Duchenne 肌营养不良症（肌营养不良蛋白DMD cDNA ~14 kb）或锥杆状肌营养不良症（ABCA4 cDNA ~6.8 kb）。正如 Sánchez-Mejías 博士解释的那样，为了规避这一交付挑战，该团队转向 piggyBac 转座酶：

»在细菌中，已经表明可以通过将 CRISPR-Cas 与转座子元件相结合来执行精确的基因传递：许多物种中存在的天然“跳跃基因”，可以自我切除以重新定位到基因组中的其他区域。然而，CRISPR 可编程转座子技术在哺乳动物细胞中不起作用。这是我们面临的挑战，让 CRISPR-Cas 和 piggyBac 转座酶协同工作。

团队合作让基因写入更好

为了使这个项目成功，一个协同研究团队由不同专业领域组成，包括经典遗传学、进化、计算和合成生物学以及蛋白质工程。»第一步是在 Cas9 和 piggyBac 转座酶之间进行蛋白质-蛋白质融合，并创建一个荧光报告系统，在成功交付 CRISPR 引导的有效载荷后点亮细胞。» （图 1A）。

»piggyBac 与核酸酶活性 Cas9 的羧基末端融合显示出最佳的转座子 DNA 递送能力。然而，特异性仍然是一个问题，因为转座酶的内源 DNA 结合能力也会导致转座子插入其他基因组位点，”Sánchez-Mejías 博士解释说。

Güell 教授解释了该团队如何应对这一挑战：»为了解决这一特异性问题，我们需要分离融合的 Cas 和 piggyBac 蛋白的功能。由于可编程 Cas9 用于寻找基因组目标并为有效负载插入创建双链断裂，因此不再需要转座酶的天然 DNA 结合亲和力 - 甚至是不可取的，因为这会导致脱靶。因此，我们设计了 piggyBac 使其失去其 DNA 结合亲和力。我们基于先前确定的突变和蛋白质建模进行了这项工作，使用结构预测算法通过比较相关蛋白质的 DNA 结合域来识别关键残基。«

Sánchez-Mejías 博士解释了去除 piggyBac 的 DNA 结合亲和力如何带来额外的优势。»这些修改的结果是，基因组靶位点不再需要 DNA 整合通常需要的 TTAA 转座识别和插入基序。在两端具有所需反向重复的转座子 DNA 有效负载很好地定位在 Cas9 创建的靶向双链断裂中。在这个位置，我们的实验确实揭示了频繁的小插入缺失，这可能是 DNA 末端处理机制与转座相结合的结果。«（图 1B）。»然而，重要的是，插入的 DNA 有效负载将引导 RNA (gRNA) 识别序列与原型间隔区激活基序分开，从而阻止了循环 Cas9 活性。

图 1. FiCAT 基因写入技术。A. Cas9-piggyBac 融合蛋白和转座子插入目标位点。B. FiCAT 插入后 DNA 连接的表征。改编自 Pallarès-Masmitjà 等人，Nat。通讯。（2021 年）。https://doi.org/10.1038/s41467-021-27183-x

 

Joey Riepsaame 博士，牛津大学威廉邓恩爵士病理学学院基因组工程负责人，没有参与当前的研究，他认为 FiCAT 是基因编辑领域潜在的重大进步：

»Maria Pallarès-Masmitjà 及其同事在 Nature Communications 中描述的查找、剪切和转移 (FiCAT) 系统很好地补充了 Hew等人的工作。在 2019 年首次表明，与 piggyBac 转座酶 (PBase) 突变体融合的无催化活性 Cas9 (dCas9) 可以有效地将位于两个反向末端重复 (ITR) 序列之间的大型质粒衍生 DNA 货物安装到哺乳动物基因组中。虽然有效，但这种 dCas9-PBase 杂交体倾向于将其转座子货物整合到散布在整个基因组中的随机 TTAA piggyBac 插入序列中，从而导致不需要的编辑。通过在该系统中用催化活性 Cas9 替换 dCas9，Pallarès-Masmitjà等人. 似乎已经解决了这个问题，并首次表明 FiCAT 在 gRNA 定义的目标位点专门安装了长达 9.5 kb 的转座子衍生的 DNA 货物。与其前身不同，FiCAT 介导的转座似乎依赖于 gRNA，因为 DNA 货物被特异性插入在 Cas9 切割位点/附近，而不是附近或随机的 TTAA 插入序列。因此，FiCAT 可能是将大型 DNA 序列特异性和稳定地引入哺乳动物基因组内用户定义的目标位点的重要一步。

临床 FiCAT 应用的途径

在确定了 FiCAT 的潜在临床价值后，Sánchez-Mejías 博士解释了未来发展的下一步：

从一开始，为有需要的患者提供这项技术非常重要。我们认为推动临床开发进程的最佳方式是创建一家衍生公司 Integra Therapeutics。我们很清楚，制药行业的参与对于将 FiCAT 从实验室带入临床至关重要。我们很幸运地在巴塞罗那找到了一个非常有用的商业发展环境，它为知识产权保护提供了资金支持，并提供了有关技术转让、战略规划以及如何吸引我们进一步开发用于治疗的 FiCAT 所需的必要风险资本的知识。

目前，Integra Therapeutics的研究进展尚未集中在患有特定遗传疾病的特定患者身上。»我们仍然真正以技术平台本身为中心。至关重要的是，我们准确地了解 FiCAT 可以为基因写入领域带来什么，”Güell 教授说，他继续说道：“此外，我们需要专注于靶向细胞和组织以及实施哪些递送系统。在我们真正开始对患者进行临床试验之前，这一切都必须在临床前模型中得到验证。«

在这种情况下，应该注意的是，FiCAT 基因写入应用程序不仅限于纠正基因缺失。正如 Güell 教授所阐述的那样，FiCAT 也适用于开发新的免疫细胞疗法来对抗癌症： »它可能有助于将嵌合抗原受体 (CAR) 盒有效地递送到安全港位点。此外，FiCAT 通过实现基于 cDNA 的微型基因的靶向插入而具有临床前景。这种策略可能会补偿许多具有相同功能障碍基因的患者的不同功能突变损失，避免需要为每个患者设计量身定制的基因编辑策略独特的病人。

Sánchez-Mejías 博士说了最后一句话：»我们确实认为 FiCAT 是一种用途广泛的资产，具有实际治疗不同遗传疾病的巨大潜力。因此，虽然我们还没有针对特定患者，但我们正在努力实现 FiCAT 的临床应用，这真的很令人兴奋。

iCAT 性能和定向进化

在建立了查找、剪切和转移 (FiCAT) 基因编辑技术的原理证明后，进行了实验以确定其有效性。在它们的自然通信12月3日发表的论文次，2021，团队报道了FICAT导致高两倍递送效率相比于涉及HDR方法或增强的HITI创建有针对性的DNA插入，实现插入多达8 kb的高精度（图 2 A、B)。经过一些调整和优化后，FiCAT 的靶向插入效率可以提高到培养细胞的 22%（图 2C），早期的实验表明脱靶风险是可控的并且与sp Cas9相当。

FiCAT 的另一个潜在优势是可以使用环状 DNA 模板，这与 HDR 或 HITI 所需的线性 DNA 片段相反，后者更可能与增加的基因组毒性和不受控制的插入风险有关。

»在组织培养实验的基础上，我们研究了 FiCAT 引导的转座是否也可以在体内使用，« Güell 教授说。» 转座子质粒或小环与 gRNA 和编码 Cas9-piggyBac 酶的 mRNA 相结合，通过流体动力学注射或封闭在体内JetPei® 颗粒中注射到小鼠的血流中。我们将转座子递送到小鼠肝细胞中的安全港Rosa基因座中，并通过荧光报告蛋白或荧光素酶表达确认成功递送。在 4 到 5 周的时间范围内通过持续的转基因表达证实了稳定的分娩«。（图 2D）。

»我们现在已经确定，我们已经开发了一种具有潜在临床功能的基因编写工具，并且我们付出了很多努力来通过定向进化来优化 FiCAT。专注于 17 个特定氨基酸，我们创建了近 200,000 个 FiCAT 变体，这些变体在慢病毒组合文库中进行了筛选以了解其功效。这样，我们就能够进一步降低 piggyBac 的内在 DNA 结合能力，同时提高 DNA 有效负载插入的熟练程度。«，Güell 教授说。

图 2. FiCAT 效率。A.FiCAT 与 HDR。B.FiCAT 与增强型 (e)HITI。C. 在 C2C12 小鼠成肌细胞中优化的 FiCAT。D. FiCAT 的体内靶向转座子递送。游离型：仅不含 Cas-piggyBac 的 DNA。Pallarès-Masmitjà 等人，Nat。通讯。（2021 年）。https://doi.org/10.1038/s41467-021-27183-x

Joey Riepsaame 博士，牛津大学威廉邓恩爵士病理学学院基因组工程负责人，没有参与当前的研究，他认为 FiCAT 是基因编辑领域潜在的重大进步：

»Maria Pallarès-Masmitjà 及其同事在 Nature Communications 中描述的查找、剪切和转移 (FiCAT) 系统很好地补充了 Hew等人的工作。谁在 2019 年首次表明，与 piggyBac 转座酶 (PBase) 突变体融合的无催化活性 Cas9 (dCas9) 可以有效地将位于两个反向末端重复 (ITR) 序列之间的大型质粒衍生 DNA 货物安装到哺乳动物基因组中。虽然有效，但这种 dCas9-PBase 杂交体倾向于将其转座子货物整合到散布在整个基因组中的随机 TTAA piggyBac 插入序列中，从而导致不需要的编辑。通过在该系统中用催化活性 Cas9 替换 dCas9，Pallarès-Masmitjà等人. 似乎已经解决了这个问题，并首次表明 FiCAT 在 gRNA 定义的目标位点专门安装了长达 9.5 kb 的转座子衍生的 DNA 货物。与其前身不同，FiCAT 介导的转座似乎依赖于 gRNA，因为 DNA 货物被特异性插入在 Cas9 切割位点/附近，而不是附近或随机的 TTAA 插入序列。因此，FiCAT 可能是将大型 DNA 序列特异性和稳定地引入哺乳动物基因组内用户定义的目标位点的重要一步。«

临床 FiCAT 应用的途径

在确定了 FiCAT 的潜在临床价值后，Sánchez-Mejías 博士解释了未来发展的下一步：

从一开始，为有需要的患者提供这项技术非常重要。我们认为推动临床开发进程的最佳方式是创建一家衍生公司 Integra Therapeutics。我们很清楚，制药行业的参与对于将 FiCAT 从实验室带入临床至关重要。我们很幸运地在巴塞罗那找到了一个非常有用的商业发展环境，它为知识产权保护提供了资金支持，并提供了有关技术转让、战略规划以及如何吸引我们进一步开发用于治疗的 FiCAT 所需的必要风险资本的知识。

目前，Integra Therapeutics的研究进展尚未集中在患有特定遗传疾病的特定患者身上。»我们仍然真正以技术平台本身为中心。至关重要的是，我们准确地了解 FiCAT 可以为基因写入领域带来什么，”Güell 教授说，他继续说道：“此外，我们需要专注于靶向细胞和组织以及实施哪些递送系统。在我们真正开始对患者进行临床试验之前，这一切都必须在临床前模型中得到验证。

在这种情况下，应该注意的是，FiCAT 基因写入应用程序不仅限于纠正基因缺失。正如 Güell 教授所阐述的那样，FiCAT 也适用于开发新的免疫细胞疗法来对抗癌症： 它可能有助于将嵌合抗原受体 (CAR) 盒有效地递送到安全港位点。此外，FiCAT 通过实现基于 cDNA 的微型基因的靶向插入而具有临床前景。这种策略可能会补偿许多具有相同功能障碍基因的患者的不同功能突变损失，避免需要为每个患者设计量身定制的基因编辑策略独特的病人。

Sánchez-Mejías 博士说了最后一句话：我们确实认为 FiCAT 是一种用途广泛的资产，具有实际治疗不同遗传疾病的巨大潜力。虽然我们还没有针对特定患者，但我们正在努力实现 FiCAT 的临床应用，这真的很令人兴奋。