一、在 CRISPR 系统之外发现了新的可编程基因编辑蛋白

研究人员发现 RNA 引导的酶比以前认为的更加多样化和广泛。

詹妮弗·米查洛夫斯基 | 麦戈文脑研究所     发布日期：2021 年 9 月 15 日

在过去十年中，科学家们已经将 CRISPR 系统从微生物应用于基因编辑技术，这是一种用于修改 DNA 的精确且可编程的系统。现在，麻省理工学院麦戈文脑研究所以及麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的科学家们发现了一类新的可编程 DNA 修改系统，称为 OMEGA（强制移动元素引导活动），它可能自然地参与整个过程中小部分 DNA 的改组、细菌基因组。

这些古老的 DNA 切割酶被小片段 RNA 引导到它们的目标。虽然它们起源于细菌，但现在已经被设计为在人类细胞中工作，这表明它们可能有助于基因编辑疗法的开发，特别是因为它们很小（大约是 Cas9 大小的 30%），使它们更容易比体积更大的酶传递给细胞。9 月 9 日发表在《科学》杂志上的这一发现提供了证据，证明天然 RNA 引导的酶是地球上最丰富的蛋白质之一，指向一个广阔的生物学新领域，该领域有望推动基因组编辑技术的下一次革命。

该研究由麦戈文研究员张锋领导，张锋是麻省理工学院神经科学教授、霍华德休斯医学研究所研究员、博德研究所核心研究所成员。张的团队一直在探索自然多样性，以寻找可以合理编程的新分子系统。

“我们对这些广泛存在的可编程酶的发现感到非常兴奋，它们一直隐藏在我们的眼皮底下，”张说。“这些结果表明，有更多可编程系统作为有用技术等待发现和开发，这是一种诱人的可能性。”

自然适应

可编程酶，尤其是那些使用 RNA 指导的酶，可以快速适应不同的用途。例如，CRISPR 酶自然地使用 RNA 向导来靶向病毒入侵者，但生物学家可以通过生成自己的 RNA 向导将 Cas9 定向到任何目标。麻省理工学院生物工程研究生、该论文的共同第一作者 Soumya Kannan 说：“改变一个指导序列并设定一个新目标是如此容易。” “所以我们感兴趣的一个广泛问题是试图看看其他自然系统是否使用同样的机制。”

OMEGA 蛋白质可能受 RNA 指导的第一个暗示来自称为 IscB 的蛋白质基因。IscB 不参与 CRISPR 免疫，也不知道与 RNA 相关联，但它们看起来像小的 DNA 切割酶。该团队发现每个 IscB 附近都有一个小 RNA 编码，它指导 IscB 酶切割特定的 DNA 序列。他们将这些 RNA 命名为“ωRNA”。

该团队的实验表明，另外两类小蛋白 IsrBs 和 TnpBs（细菌中最丰富的基因之一）也使用 ωRNA 作为指导来指导 DNA 的切割。

IscB、IsrB 和 TnpB 存在于称为转座子的移动遗传元件中。麻省理工学院生物工程研究生、论文的共同第一作者 Han Altae-Tran 解释说，每次这些转座子移动时，它们都会产生一个新的引导 RNA，允许它们编码的酶在其他地方切割。

目前尚不清楚细菌如何从这种基因组改组中受益——或者它们是否会受益。Kannan 说，转座子通常被认为是自私的 DNA 片段，只关心它们自己的移动性和保存性。但如果宿主可以“选择”这些系统并重新利用它们，宿主可能会获得新的能力，就像赋予适应性免疫的 CRISPR 系统一样。

IscBs 和 TnpBs 似乎是 Cas9 和 Cas12 CRISPR 系统的前身。该团队怀疑它们与 IsrB 一起也可能产生了其他 RNA 引导的酶——他们渴望找到它们。Kannan 说，他们对自然界中可能由 RNA 引导的酶执行的一系列功能感到好奇，并且怀疑进化可能已经利用了 IscB 和 TnpB 等 OMEGA 酶来解决生物学家热衷于解决的问题。

Altae-Tran 说：“我们一直在考虑的很多事情可能已经以某种方式自然存在。这些类型系统的自然版本可能是适应该特定任务的良好起点。”

该团队还对追踪 RNA 引导系统进一步向过去的演变感兴趣。“发现所有这些新系统有助于了解 RNA 引导系统是如何进化的，但我们不知道 RNA 引导活动本身从何而来，”Altae-Tran 说。他说，了解这些起源可以为开发更多种类的可编程工具铺平道路。

这项工作得到了麻省理工学院西蒙斯社会大脑中心、美国国立卫生研究院及其校内研究项目、霍华德休斯医学研究所、开放慈善事业、G. Harold 和 Leila Y. Mathers 慈善基金会、Edward Mallinckrodt 的支持。 , Jr. Foundation，麻省理工学院 Poitras 精神病研究中心，麻省理工学院自闭症研究中心 Hock E. Tan 和 K. Lisa Yang，麻省理工学院 Yang-Tan 分子治疗中心，Lisa Yang，Phillips 家族，R. Metcalfe，和 J. 和 P. Poitras。

二、研究人员开发出迄今为止最小的用于基因组编辑的 CRISPR

就目前而言，发现的 CRISPR 中只有不到 1% 可以在人体细胞中发挥作用，因为它们太大而无法容纳。（Ernesto del Aguila III，国家人类基因组研究所，NIH）

用于人类细胞的 CRISPR-Cas 系统的开发彻底改变了基因组工程。这些系统为开发各种遗传疾病的基因疗法提供了机会。但是它们的大尺寸通常会限制递送到细胞中，从而阻碍临床应用。例如，腺相关病毒（AAV）作为一种广泛应用于体内递送的载体，其有效载荷的包装能力有限（小于4.7 kb），许多Cas融合蛋白都超出了这个限制。因此，需要设计高效、紧凑的 Cas 系统，以促进下一代基因组工程应用。

一种可能的解决方案是 Cas12f，也称为 Cas14。该蛋白质的大小介于 400 到 700 个氨基酸之间，比目前使用的 CRISPR 系统（例如 Cas9 或 Cas12a）的大小还不到一半。但直到现在，还不清楚这种紧凑型蛋白质是否可以用于哺乳动物细胞。“近年来已经鉴定出数千个 CRISPR，它们被称为细菌的免疫防御系统，”齐解释说。“然而，超过 99.9% 的已发现 CRISPR 无法在人类细胞中发挥作用，这限制了它们作为基因组编辑技术的使用。”

在这项新研究中，Qi 和他的团队将 RNA 和蛋白质工程应用于 Cas12f 系统，以生成用于哺乳动物基因组工程的高效微型 Cas 系统。源自古细菌的天然 Cas12f 蛋白及其单导 RNA 在哺乳动物细胞中没有显示出可检测的活性。通过优化单向导 RNA 设计并进行多轮迭代蛋白质工程和筛选，研究人员生成了一类名为 CasMINI 的 Cas12f 变体。

工程化的 Cas12f 蛋白质变体与工程化的单向导 RNA 相结合，表现出有效的基因调控和基因编辑活性。研究人员证明，CasMINI 可以驱动与 Cas12a 相关的高水平基因激活，并允许进行稳健的碱基编辑和基因编辑。此外，它具有高度特异性，不会产生可检测的脱靶效应。

“在这里，我们通过合理的 RNA 工程和蛋白质工程将哺乳动物细胞中的非工作 CRISPR 转变为高效工作的 CRISPR，”齐说。“其他人之前曾努力提高工作 CRISPR 的性能。但我们的工作是第一个使非工作 CRISPR 工作的工作。这凸显了生物工程实现进化尚未完成的事情的力量。”

工程化 CasMINI 分子的大小仅为 529 个氨基酸。这种小尺寸使其适用于广泛的治疗应用。例如，CasMINI 融合蛋白非常适合 AAV 包装。此外，CasMINI mRNA 可以很容易地包装到脂质纳米颗粒或其他 RNA 递送方式中，从而有可能增强其进入细胞的能力。它的小尺寸和非人类病原体来源可能使它比大蛋白质有效载荷更不可能产生免疫反应。

需要做更多的工作来进一步优化 CasMINI 在碱基编辑和基因编辑方面的效率，并用不同的递送方式在体内测试系统的性能。研究人员计划测试该系统的体内基因治疗应用。

“微型 CasMINI 的可用性使新的应用成为可能，从体外应用，如设计更好的肿瘤杀伤淋巴细胞或重编程干细胞到体内基因治疗，以治疗眼睛、肌肉或肝脏的遗传疾病，”齐说。“在我们的愿望清单上，它将成为治疗遗传疾病、治愈癌症和逆转器官退化的疗法。”

相关链接：迷你 CRISPR 系统可能是基因编辑中的“瑞士刀”

三、Cell重磅 | 基因治疗的革命性研究成果，将AAV进行定向进化，有望将“药物”递送到任何组织

替换或编辑致病突变为治疗许多人类疾病带来了巨大希望。然而，在体内向特定细胞递送治疗性遗传修饰剂一直具有挑战性，尤其是在解剖学上分布的大型组织（如骨骼肌）中。

2021年9月9日，博德研究所Mohammadsharif Tabebordbar等人在Cell 在线发表题为“Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species”的研究论文，该研究建立了一种体内策略来进化和严格选择腺相关病毒 (AAV) 的衣壳变体，这些变体能够有效地递送到所需的组织。使用这种方法，该研究确定了一类含有 RGD 基序的衣壳，其在小鼠和非人类灵长类动物中静脉注射后以优异的效率和选择性递送到肌肉。在两种遗传性肌肉疾病小鼠模型中，证明了与天然存在的 AAV 衣壳相比，这些工程载体的效力和治疗功效显著增强。该研究的选择方法中的最优衣壳变体显示出在各种近交小鼠品系以及食蟹猴和人类原代肌管中递送的保守效力，递送依赖于靶细胞表达的整合素异二聚体。

总之，该研究报告了跨物种的高效肌肉定向 AAV 衣壳变体家族的进化、工程和机制表征。 该研究在多个遗传性肌肉疾病小鼠模型中证明了这些载体的治疗功效，即使在低剂量下也是如此。这些载体有可能促进针对大量肌肉骨骼疾病的肌肉定向治疗基因递送。更广泛地说，此处描述的 DELIVER 系统提供了一个高度适应性的平台，用于识别体内任何组织或细胞类型的精确 AAV 衣壳变体，这可以极大地扩展该载体系统跨领域和学科的临床和实验应用。研究人员预计，在其他组织和器官系统中采用 DELIVER 将在加速基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化方面产生深远的影响，以治疗各种人类疾病。

截至发稿前，基因编辑领域的前沿公司CRISPR Therapeutics，Editas Medicine等大涨。

重组腺相关病毒 (rAAV) 是临床前和临床研究中最常用于体内基因替代治疗和基因编辑的载体，但全身递送后特定组织的选择性递送仍然是一个挑战。使用天然衣壳产生的重组 AAV 在全身注射后主要隔离在肝脏中。这种隔离限制了其他器官的递送效率，并对向骨骼肌传递基因提出了特殊挑战。由于肌肉占全身质量的 40%，在具有天然衣壳变体的肌肉中达到治疗阈值需要极高的病毒剂量 (~2E+14 vg/kg)，这为载体制造和正如在最近的一些临床试验中所观察到的那样，可能导致治疗限制性毒性。

AAV 衣壳蛋白工程与体内选择相结合是一种有前途的方法，可以将有效和选择性的基因传递到各种组织。AAV 衣壳导向的进化策略通常涉及生成不同的衣壳文库，然后在细胞培养和/或动物模型中选择具有所需向性的变体。这种方法产生了改进的载体，用于增强向许多组织的递送。

为了取得最大成功，定向进化方法必须能够在 mRNA 水平上严格选择不同菌株和物种的功能性衣壳变体。AAV 递送是一个多步骤过程，包括与细胞表面受体结合、细胞内运输、内体逃逸、核进入、载体基因组第二链 DNA 合成和转基因表达，并且这些步骤中的任何一个的低效率都会限制载体效力。因此，成功鉴定有效的衣壳需要选择在递送的所有阶段都能有效进行的变体。

然而，大多数体内衣壳定向进化策略是根据载体基因组 DNA 而非转基因 mRNA 在感兴趣组织中的存在来选择成功的衣壳变体。涉及 AAV 递送的基因的编码序列和表达的物种和菌株特异性差异提出了另一个挑战，因为在特定小鼠菌株中选择的衣壳变体可能不会在其他菌株或其他物种中产生有效的递送。

在这里，该研究开发了 DELIVER（利用转基因 RNA 体内表达的 AAV 衣壳定向进化）策略，将不同衣壳文库的生成与严格的基于转录本的体内选择相结合，并实现定向进化，然后识别任何组织中的功能性衣壳变体。该研究应用 DELIVER 在小鼠和非人类灵长类动物 (NHP) 中开发肌肉嗜性衣壳，并将该研究的结果与 AAV9 和 AAVrh74 进行比较，这两者都是目前用于杜氏肌营养不良症 (DMD) 基因替代试验的天然 AAV 衣壳。总体而言，与 AAV9 和 AAVrh74 相比，该研究的肌肉导向载体在骨骼肌和心脏组织的递送方面表现出卓越的效力和选择性。这些载体进一步证明了跨小鼠、NHP 和人类肌肉细胞的保守递送效力。

小鼠和 NHP 中富含肌肉的变异衣壳序列的交叉比较确定了变异中常见的精氨酸 – 甘氨酸 – 天冬氨酸（RGD）基序。总之，这项工作提供了一类 AAV 衣壳变体，特别适用于横纹肌的治疗开发和测试。它还提供了一个全面的实验框架，用于未来具有替代组织嗜性的其他 AAV 家族的进化。研究人员预计，在其他组织和器官系统中采用 DELIVER 将在加速基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化方面产生深远的影响，以治疗各种人类疾病。

四、FDA 委员会与诺华的 Zolgensma 一起解决复杂的基因治疗安全问题，提供经验教训

基因治疗生物技术公司已准备好进行一系列临床试验，以测试人类潜在的开创性治疗方法。但一系列复杂的安全问题仍有待解决——包括确定用于临床前研究的正确动物模型，以确保人体试验的安全，以及确定如何安全地提供药物。